ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 4256—2026 牛疱疹病毒 4型感染诊断技术 Diagnostic techniques for bovine herpesvirus 4 infection 2026-01-15发布 2026-02-15实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 4256 —2026 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19 ）归口。 本文件起草单位： 金宇保灵生物药品有限公司、 内蒙古金迈诗生物科技有限公司、 内蒙古农业大学、 内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、土默特左旗动物疫病防控中心、通辽市动物疫病预防控制中心、 内蒙古自治区质量和标准化研究院。 本文件主要起草人：刘玉梅、刘东霞、赵利平、张彦婷、陈学飞、关平原、李劼、徐晓静、赵丽霞、 郭宇、刘慧、庄金山、刘利军、石明伟、张鸣华、杨晓婷、宋鑫。 DB15/T 42 56—2026 1 牛疱疹病毒 4型感染诊断 技术 1 范围 本文件规定了牛疱疹病毒 4型感染临床诊断和实验室诊断技术方法、操作程序和判定标准，包含样 品采集、保存和处理，病毒分离与鉴定，实时荧光 PCR以及病毒中和抗体检测技术。 本文件适用于牛饲养场（户）和动物疫病检疫、诊疗单位对牛疱疹病毒 4型感染的诊断、监测和流 行病学调查等。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 牛疱疹病毒 4型（牛伽玛疱疹病毒 4型,BoHV-4） bovine gammaherpesvirus 4,BoHV -4 属于正疱疹病毒科 (Orthoherpesviridae) 、γ-疱疹病毒亚科（ Gammaherpesvirinae ）、细长病毒 属（Rhadinovirus ），是一种双链 DNA病毒，病毒颗粒较大（直径 150 nm～200 nm），是有囊膜的二十 面体粒子，基因组大小约 144 kb。 牛疱疹病毒 4型感染 bovine he rpesvirus type 4 infection 牛伽玛疱疹病毒 4型（Bovine gammaherpesvirus 4,BoHV -4）侵入牛体的组织、器官，在其中生长、 繁殖，并引起宿主出现病理反应的过程。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BoHV-4：牛疱疹病毒 4型（Bovine Herpesvirus type 4 ，BoHV4） CPE：致细胞病变效应（ Cytopathic Effect ） DMEM：DMEM培养基（ DuLbecco ’s Modified Eagle Medium ） DB15/T 4256 —2026 2 MDBK 细胞：牛肾细胞（ Bovine Kidney Cells ） NBS：新生牛血清（ Newborn Bovine Serum ） PBS：磷酸盐缓冲溶液（ Phosphate Buffer Saline ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ） TCID 50：半数细胞培养物感染量（ Median Tissue Culture Infective Dose ） 5 生物安全措施 样品采集的生物安全措施应符合 GB/T 274 01的规定,样品处理的生物安全措施应符合 GB 19489 的规 定。 6 临床诊断 流行病学 6.1.1 易感动物 通常主要感染牛，也可感染绵羊、山羊、豚鼠等，导致已感染动物出现繁殖障碍。 6.1.2 传染源 病畜和带毒畜为主要传染源。 6.1.3 传播途径 本病通过直接接触传播，也可通过间接接触传播，接触病畜和带毒畜的口鼻分泌物、生殖道分泌物 均可感染本病，人工受精、胚胎移植也是其传播的潜在途径。 6.1.4 流行特点 一年四季均可发生感染，无明显的季节性，与气候或温度变化无显著关联。 临床症状 大多数呈隐性感染，发病牛主要临床症状表现为产后子宫炎、流产，翻开外阴肉眼可见点状白色水 泡疹。 病理变化 子宫肿大，子宫内膜充血、水肿，子宫壁增厚，子宫腔内可见大量浑浊、脓性渗出物。流产的胎儿 可能自溶，或可见肝脏坏死等病变。 结果判定 当牛出现上述症状和病理变化时，可判定为牛疱疹病毒 4型感染的疑似病例。 7 实验室诊断 病毒分离鉴定 DB15/T 4256 —2026 3 7.1.1 主要试剂耗材 7.1.1.1 MDBK细胞系。 7.1.1.2 无菌棉拭子。 7.1.1.3 NBS。 7.1.1.4 DMEM培养基。 7.1.1.5 青霉素（ 100 U/mL ）。 7.1.1.6 链霉素（ 100 μg/mL）。 7.1.1.7 细胞培养板。 7.1.1.8 2%磷钨酸。 7.1.2 主要仪器 7.1.2.1 电子天平。 7.1.2.2 研磨仪。 7.1.2.3 台式冷冻离心机。 7.1.2.4 生物安全柜。 7.1.2.5 CO2培养箱。 7.1.2.6 倒置显微镜。 7.1.2.7 冰箱。 7.1.2.8 微量可调移液器（ 20 μL～200 μL、100 μL～1000 μL、1000 μL～5000 μL）。 7.1.2.9 电子显微镜。 7.1.2.10 超速冷冻离心机。 7.1.3 样品采集与保存 7.1.3.1 采集与保存原则 按照NY/T 541 执行。 7.1.3.2 拭子 用无菌棉拭子反复刮擦眼结膜、呼吸道粘膜、阴道粘膜、阴茎或包皮黏膜 5～10次，蘸取分泌物后 将棉拭子浸入 2 mLPBS（配制方法按照附录 A中的A.1执行）中， 4 ℃冷藏运输， 24 h内送至实验室；对 于不能在 24 h内送达实验室样品，应以冷冻状态运送。取样进行检验时，振荡、挤干拭子，浸泡液采用 4,000 g离心1 min，取上清液 -20 ℃保存备用。 7.1.3.3 精液 取解冻或新鲜精液样品 1 mL～1.5 mL于微量离心管中，振荡混匀，采用 5,000 g离心30 s，取上清 液-20 ℃保存备用。 7.1.3.4 组织样品 无菌采集流产物或流产胎儿组织脏器 1 g以上剪碎，加入 2 mLPBS（配制方法按照附录 A中的A.1执 行），于研钵或组织匀浆器中研磨制成悬液， 5,000 g离心20 min，取上清液 -20 ℃保存备用。 7.1.3.5 血清 DB15/T 4256 —2026 4 用采样器采集待检活牛静脉血 2 mL～5 mL，4 ℃保存， 24 h内送至实验室。待凝固后， 2,000 g离 心5 min，取上清液 -20 ℃保存备用。 7.1.4 病毒分离 取临床样品的处理组织液， 经 0.22 μm针头滤器无菌过滤后， 按照 10%的比例接种到长满单层的 MDBK 细胞，按千分之一比例添加 10万单位青链霉素混合液（配制方法按照附录 A中A.2执行），置于 37 ℃， 含5%CO 2的培养箱中吸附 1 h ～2 h 后，弃去处理组织液，根据培养容器重新加入适量病毒维持液（配 制方法按照附录 A中A.3执行），同时设对照组，置于 37 ℃，5%CO 2培养箱，培养 3 d～5 d，逐日观察， 记录细胞病变。如 3 d～5 d内不出现病变，按上述方法盲传 3～5代，每代逐日观察细胞病变，当出现细 胞变圆、大量脱落、贴壁细胞变长、聚集形成网状的典型病变（见附录 B中B.1），则进行病毒特异性鉴 定。 7.1.5 病毒鉴定 7.1.5.1 取出现典型细胞病变培养物，反复冻融 3次，以3000 g离心10 min，取上清提取 DNA，采用 实时荧光 PCR进行核酸检测，进一步鉴定是否为 BoHV4。 7.1.5.2 取采集组织样本制成 1:5 PBS 悬液或细胞培养物 3000 g离心30 min，取上清， 15000 g离 心30 min ，取上清，以 40000 g离心5 h，弃上清，加 0.5 mL蒸馏水悬浮，滴加铜网， 2%磷钨酸负染 30 min，室温下自然干燥后，电镜下观察病毒粒子形态。如电镜下观察发现，完整病毒颗粒 (含包膜)直 径约为150 nm～200 nm,呈球形，包膜表面可见糖蛋白形成的刺突结构（见附录 B中B.2）。可初步判 定为牛疱疹病毒 4型疑似病例。（选做） 实时荧光 PCR 7.2.1 主要试剂耗材 7.2.1.1 微量可调移液器（ 1 μL～10 μL、10 μL～100 μL、20 μL～200