QB ICS 67.160.10 分类号：X62 备案号：37974-2013 中华人民共和国轻工行业标准 QB/T 4356-2012 黄酒中游离氨基酸的测定 高效液相色谱法 Determination of free amino acids in Chinese rice wine High performance liquid chromatography 2012-11-07发布 2013-03-01实施 发布 中华人民共和国工业和信息化部 QB/T4356-2012 前言 本标准按GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国食品发酵标准化中心提出并归口。 本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院、上海金枫酒业股份有限公司、浙江古越龙山绍兴酒股 份有限公司、中粮绍兴酒有限公司、苏州华测生物技术有限公司。 本标准主要起草人：钟其顶、熊正河、傅建伟、胡健、邹慧君、方逸群、吕兴龙、金建江、郭冰、 高红波。 QB/T4356-2012 黄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法 1范围 本标准规定了异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生高效液相色谱测定黄酒游离氨基酸的方法。 本标准适用于黄酒中天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、组氨酸 （His）、精氨酸（Arg）、-氨基丁酸（Gaba）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪 氨酸（Tyr）、缬氨酸（Va1）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、 色氨酸（Trp）、赖氨酸（Lys）共18种游离氨基酸测定，氨基酸检出限为1.0mg/L。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规则和实验方法 3原理 采用异硫氰酸苯酯衍生剂与黄酒中游离氨基酸进行衍生反应，氨基酸衍生产物在特定紫外波长有强 吸收，经色谱柱分离后，紫外检测器检测，外标法定量分析， 4试剂 除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.12 乙腈：色谱纯。 4.2异硫氰酸苯酯（不小于98%）。 4.3三乙胺：分析纯。 4.4无水乙酸钠。 4.5正已烷。 4.6冰乙酸（不小于99.0%）。 4.7 浓盐酸。 4.8头 异硫氰酸苯酯的乙腈溶液：移取0.12mL异硫氰酸苯酯至10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度混 匀。 4. 9 三乙胺-乙溶液：移取1.40mL三乙胺至10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀。 4.1020%（体积比）乙酸溶液：取2mL冰乙酸至10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。 4.110.1mol/L盐酸溶液：取0.90mL浓盐酸至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。 4.12氨基酸标准物质(具体名称见附录A)：纯度不小于98%。 4.13标准储备液：准确称取一定质量的各氨基酸标准品，用0.1mol/L盐酸溶解，混匀，使其浓度为 0.50mg/mL，配制的标准储备液在4℃冰箱保存，有效期3个月。 4.14标准工作液：准确量取标准储备液，用水稀释，依次配制成10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80 μg/mL的标准溶液。 5仪器和材料 5.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 5.2分析天平（精度0.1mg）。 1 QB/T4356-2012 5.3涡旋混合器 5.4带塞试管。 5.5微孔滤膜：孔径0.45μm（有机系和水系）。 6分析步骤 6.1样品衍生 准确吸取黄酒样品1.0mL，于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，取500μL稀释后的酒样， 置于带塞试管中，加入异硫氰酸苯酯的乙腈溶液（4.8）250μL、三乙胺-乙腈溶液（4.9）250μL，混匀， 室温下放置1h后，加入50uL乙酸溶液（4.10），混匀。 6.2萃取净化 向上述衍生后的溶液中加入1.0mL正已烷（4.5），涡旋混合器振荡1min，静置分层后，弃去上层 正已烷溶液，采用针头注射器小心吸取下层溶液，经0.45um有机系滤膜过滤，用于液相色谱测定。 6.3标准工作液衍生 分别移取500μL系列标准工作液（4.14），置于带塞试管(5:4)中，加入异硫氰酸苯酯的乙睛溶液（4.8） 250μL、丰乙胺-乙睛溶液（4.9）250μL，混匀，室温下放置1h后，加入50μL乙酸溶液（4.10），混匀， 按6.2进行萃取净化。 6.4参考色谱条件 6.4.1色谱柱：Cig色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）或等效色谱柱。 6.4.2流动相A：称取1.64g无水乙酸钠（4.4），加适量水溶解，加入0.5mL三乙胺（4.3），用水定 容至1000mL，用20%乙酸溶液（4.10）调pH至6.20，0.45um水系滤膜过滤。流动相B：乙腈十水=8 十2（体积比），洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱程序表 时间/min A/% B/% 92 8 /2 92 8 10 90 10 12 81 19 19 74 26 21., 65 35 31 54 46 33; 0 100 36 0 100 38 .92.-* 8° 45 92 8 6.4.3流量：1.0mL/min。 6.4.4进样体积：10L。 6.4.5柱温：40℃。 6.4.6检测波长：254nm。 2 QB/T4356-2012 6.5定性 根据氨基酸标准样品的保留时间，与待测样品中组分的保留时间进行定性，定性色谱图参见附录B。 6.6外标法定量 以各氨基酸标准工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。将经6.1和6.2制备 的样品注入于液相色谱仪，测定样品中各氨基酸色谱峰面积，由标准工作曲线计算样品中的各氨基酸浓 度。 7 结果计算 7.1 样品中各组分的含量按式（1）计算获得： 1000 X,= c,×F× (1) 1000 式中： 样品中各组分的含量，单位为毫克每升（mg/L）： Xi 从标准曲线求得样品中组分的含量，单位为毫克每升（mg/L）； Ci F 样品稀释倍数。 7.2平行测定结果用算术平均值表示，保留至小数点后1位。 8精密度 在重复性测定条件下，两次独立测定结果的绝对差值不应超过其算数平均值的10%。 3 QB/T43562012 附录A （资料性附录） 18种氨基酸的分子式和相对分子质量 表A.118种氨基酸的分子式和相对分子质量 序号 中文名称 英文名称 分子式 相对分子质量 CAS号 1 天冬氨酸 Aspartic acid C,H,O,N 133.10 1783-96-6 2 谷氨酸 Glutamic acid C,H,O,N 147.13 56-86-0 3 丝氨酸 Serine C;H,O,N 105.09 56-45-1 4 甘氨酸 Glycine C,H,O2N 75.07 56-40-6 5 组氨酸 Histidine C,H,O2N3 155.16 71-00-1 6 精氨酸 Arginine CeH1402N4 174.20 74-79-3 7 -氨基丁酸 -Aminobutyric acid C,H,O2 103.12 56-12-2 8 苏氨酸 Threonine C.H,O,N 119.12 72-19-5 9 丙酸 Alanine C;H,O2N 89.09 56-41-7 10 脯氨酸 Proline C,H,O,N 115.13 147-85-3 11 酪氨酸 Tyrosine C,HiO,N 181.19 60-18-4 12 缬氨酸 Valinc CsHO,N 117.15 72-18-4 13 蛋氮酸 Methionine CHO2NS 149.21 63-68-3 14 异亮氨酸 Isoleucine C,Hi30,N 131.17 73-32-5 15 亮氨酸 Leucine CgHi3O,N 131.17 61-90-5 16 苯丙氨酸 Phenylalanine C,H,O,N 165.19 150-30-1 17 色氨酸 Tryptophan C.H1202N2 204.23 73-22-3 18 赖氨酸 Lysine C6H1402N2 146.19 56-87-1 QB/T4356-2012 附录B （资料性附录） 0.55 0.45- 0.40 Fa"o 0.15 0.10 0.053 =00 4.80 bo 3000 min 图B.118种氨基酸标准品衍生物色谱图 0.45 0.10- 0.35- Foro 025 tly 0=0- thr 0.15 0.10寸 asp 00: elu GO0 = 00 4.00 6.c0 800 min 图B.2黄酒样品中氨基酸衍生物色谱图