ICS67.120.01 X00 SB 中华人民共和国国内贸易行业标准 SB/T10923—2012 肉及肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法 Identificationof animalderived materialsinmeatand meatproducts Real-timePCR method （报批稿） （本稿完成日期：2012年12月20日） XXXX - XX - XX 发布 XXXX- XX - XX 实施 发布 中华人民共和国商务部 SB/TXXXXX—XXXX 目 次 前言 HI 1 范围. 规范性引用文件 2 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 3.2 缩略语 原理， 4 2 试剂和材料 5 2 6 仪器和设备 3 样品制备， 7 3 检验步骤 8 9 结果判定 5 10 测定下限 5 11 防止污染的措施 5 附录A（资料性附录） DNA提取裂解液配制 6 附录B（资料性附录） 检测用引物及探针序列. 附录C（资料性附录） 检测靶基因参考序列. SB/T XXXXX—XXXX 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国商务部提出并归口。 本标准起草单位：商务部流通产业促进中心。 本标准主要起草人：郑志明、郝瑞颖、张新玲、李乐、刘华琳、赵箭。 本标准系首次发布的国内贸易行业标准。 II SB/TXXXXX—XXXX 肉及肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅和兔源性成分的实时荧光PCR检测方 法。 本标准适用于肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、免源性成分的定性检测。 注：本标准中“肉及肉制品"主要指鲜（冻）肌肉组织或经过初步加工的鲜（冻）生肉制品。 2规范性引用文件 2 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的 版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T1193基因检测实验室技术要求 GB/T21103-2007动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法 3术语、定义和缩略语 3 3.1术语和定义 3.1.1 实时荧光PCRreal-timePCR 实时荧光聚合酶链式反应。 3.1.2 Ct值cycle threshold value 每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数。 3.2 缩略语 3.2.1 DNA, deoxyribonuleic acid 脱氧核糖核酸 3.2.2 FAM,carboxyfluorescein 羧基荧光素 1 SB/TXXXXX—XXXX 3. 2. 3 TAMRA, carboxy tetramethyl rhodamine 羧基四甲基罗丹明 3.2.4 Cytb,cytochrome oxidase subunit b 细胞色素氧化酶亚单位b 3. 2.5 ROX,carboxy-X-rhodamine 羧基-X-罗丹明 3.2.6 CTAB,hexadecyltrimethylammoniumbromide 十六烷基三甲基溴化铵 3.2.7 Tris, tris (hydroxymethyl) aminomethane 三（羟甲基）氨基甲烷 3.2.8 EDTA, ethylene diaminetetraacetic acid 乙二胺四乙酸 4原理 采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA的细胞色素氧化酶b亚基（Cytb)基因上畜禽各物种间 序列差异而进行动物源性成分的检测。以GenBank上公布的猪（X56295）、牛（GU249568.1）、羊（AF010406）、 马（JF511458.1)、驴（JF718884.1)、鸡(X52392)、鸭(EU755252)、鹅（AY552163.1)、兔（AJ001588)的Cyt b基因序列为模板，设计并合成各自的特异性引物对及探针：利用裂解液破碎细胞，三氯甲烧抽提去除 蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板，分别使用各物种的特异性引物对及探针进行实时荧 光PCR扩增，并通过标记报告基因羧基荧光素（FAM)、淬灭基因羧基四甲基罗丹明（TAMRA)的探针进行特 异性杂交。根据实时荧光PCR的扩增曲线和Ct值，对肉及肉制品中的动物源性成分进行检测。 5 试剂和材料 试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T27403-2008和SN/T1193的规定执行。 除另有规定外，试剂应为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的要求。 DNA提取裂解液的配制方法可参考附录A的介绍。 引物及探针序列参考附录B，检测靶基因序列参考附录C。 5.1液氮。 2 SB/T XXXXX—XXXX 5.2 2DNA提取试剂： 1%CTAB，0.05mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.7mol/LNaCl,0.01mol/LEDTA(pH8.0)，苯酚，三氯 甲烷，异戊醇，无水乙醇，70%乙醇，醋酸钠，TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCI (pH8.0), 1 mol/L EDTA (pH8.0)。 5.3 TaqMan通用PCR扩增预混试剂 6 仪器和设备 6.1 电子天平 量程2kg，感量0.1g；量程100g，感量0.001g 6. 2 组织捣碎机。 6.3 研钵（应在160℃烘烤2h） 6. 4 恒温水浴锅。 6.5 台式冷冻离心机 离心力12000g。 6.6 微量移液器 6.7 pH计。 6. 8 核酸蛋白分析仪。 6. 9 实时荧光PCR检测系统。 6.10 实时荧光PCR反应管（光学）。 6.11 易耗性耗材 应一次性使用，其他不宜烘烤或高压处理的器可使用1%次氯酸钠溶液浸泡6h后用蒸馅水冲洗 千净，去除残留氯。 7样品制备 7.1在样品粉碎区进行样品的制备。 7. 2 取样应同批多点采取肌肉组织，样品均质后，按照8.1的方法提取DNA。 注：采样过程应快速完成，将采取的样品迅速放入组织捣碎机中均质成糜状。取0.1g均质样品，放入研钵中，加 入液氮，待样品冷冻完全启快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化。 检验步骤 8 3 SB/TXXXXX—XXXX 检验过程中，参照《GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测》的规定进行。 8.1样品的总DNA提取 a) 在样品制备区进行，同时设立质控对照，阳性对照和样品分别用同样方法提取DNA。 b) 将研钵内研磨物转移到1.5mL离心管中，加入700μLDNA提取裂解液，置于65℃水浴3h， 期间不时振荡混匀： c) 12000r/min离心5min，取上清至新的1.5mL离心管内； (P 加入等体积苯酚，充分混匀后，12000r/min离心5min； e) 取上清，加等体积三氧甲烷与异戊醇的混合溶液（三氯甲烷：异戊醇的体积比为24：1），充分 混匀，12000r/min离心5min： f) 取上清，加入1/10体积的3mo1/L醋酸钠溶液，混匀后再加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20 C静置1h，12000r/min离心5min，弃去上清： g) 用70%乙醇洗涤二次，超净台内室温下晾干，加入50μLTE缓冲液溶解沉淀； h) 运用核酸蛋白分析仪对提取的DNA进行测定，0D260/0D280在1.8-2.0之间，浓度在10-100 ng/μL时，适宜于实时荧光PCR扩增。 注：也可用等效的商品化试剂盒提取组织DNA。 8.2 2实时荧光PCR检测 8.2.1扩增试剂准备 在扩增区进行扩增试剂准备，在冰盒中配制如下反应体系。每个样品测试反应体系配制如下（20叫 反应体系)： Master Mix(2x) 10. 0 μL 上游引物FP（900nM） 2. 0 μL 下游引物RP（900nM） 2. 0 μL 探针Probe（250nM） 2. 0 μL 模板DNATemplate（10-100ng） 1. 2 μL 无菌双蒸水 2.8 μL 向每个实时荧光PCR反应管中加入以上反应混合液，转移至样品制备区。 注：阳性对照用相应成分样品的DNA作为模板，阴性对照用不含相应成分样品的DNA作为模板，空白对照用等体积去 离子水作为模板。 8.2.2加样 在样品制备区进行加样。 在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备好的模板DNA溶液，盖紧管后混匀，3000r/min离心 5s~10Ss 8.2.3实时荧光PCR检测 在检测区进行实时荧光PCR检测。 a) 将8.2.2中离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。 b) 实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为：50℃2min→95℃10min-→40×（95℃ 15s-→60℃1min）收集荧光。 c) 检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。 4