书 书 书犐犆犛 ６７ ． ０４０ 犡 １１ 中华人民共和国粮食行业标准 犔犛 ／ 犜 ６１３８ — ２０２０ 粮油检验 　 粮食中黄曲霉毒素的测定免疫磁珠净化超高效液相色谱法 犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀狅犳犵狉犪犻狀犪狀犱狅犻犾狊 — 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪犳犾犪狋狅狓犻狀狊犻狀犵狉犪犻狀狊犪狀犱狅犻犾狊 — 犝犾狋狉犪犺犻犵犺犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔狑犻狋犺犻犿犿狌狀狅犿犪犵狀犲狋犻犮犫犲犪犱犮犾犲犪狀狌狆 ２０２０  ０１  ２１ 发布 ２０２０  ０７  ２１ 实施 国家粮食和物资储备局 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由国家粮食和物资储备局提出 。 本标准由全国粮油标准化技术委员会 （ ＳＡＴ ／ ＴＣ２７０ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 国家粮食和物资储备局科学研究院 、 国家粮食和物资储备局标准质量中心 、 北京东孚久恒仪器技术有限公司 、 中国储备粮管理集团有限公司 、 山东省粮油检测中心 、 广西壮族自治区粮油质量检验中心 、 四川省粮油中心监测站 、 河南口岸食品检测中心 、 遂宁市粮食质量监督检验站 、 安徽省粮油产品质量监督检测站 、 河南省粮油饲料产品质量监督检测中心 、 福建省粮油质量监测所 、 湖北省粮油食品质量监督检测中心 、 辽宁省粮油检验监测所 、 黑龙江省粮食质量安全监测中心 、 山西粮食质量监测中心 、 云南省粮油产品质量监督检验测试中心 、 内蒙古自治区粮油质量检测中心 、 昆明市粮油饲料产品质量检验中心 、 北京农业质量标准与检测技术研究中心 、 哈尔滨市粮食质量监测站 、 前郭尔罗斯蒙古族自治县粮油品质卫生检验监测站 。 本标准主要起草人 ： 王松雪 、 叶金 、 轩志宏 、 杨卫民 、 李克强 、 张志航 、 周明慧 、 王培 、 伍先绍 、 杨军 、 姬建生 、 李小明 、 胡斌 、 刘莹 、 谢婷婷 、 田国军 、 韩笑 、 徐春峰 、 李静 、 邵志凌 、 邱庆丰 、 李维香 、 陆安祥 、 赵宏伟 、 赵环宇 。 Ⅰ 犔犛 ／ 犜 ６１３８ — ２０２０粮油检验 　 粮食中黄曲霉毒素的测定免疫磁珠净化超高效液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了免疫磁珠净化超高效液相色谱测定粮食中黄曲霉毒素 Ｂ １ 、 Ｂ ２ 、 Ｇ １ 、 Ｇ ２ （ ＡＦＢ １ 、 ＡＦＢ ２ 、 ＡＦＧ １ 、 ＡＦＧ ２ ） 的原理 、 试剂和材料 、 仪器和设备 、 分析步骤 、 测定 、 结果计算和精密度等内容 。 本标准适用于小麦 、 玉米 、 稻谷和植物油等粮油样品中 ＡＦＢ １ 、 ＡＦＢ ２ 、 ＡＦＧ １ 和 ＡＦＧ ２ 的测定 。 本标准 ＡＦＢ １ 的检出限为 ０．１ μ ｇ ／ ｋｇ ， ＡＦＢ ２ 的检出限为 ０．０３ μ ｇ ／ ｋｇ ， ＡＦＧ １ 的检出限为 ０．１ μ ｇ ／ ｋｇ ， ＡＦＧ ２ 的检出限为 ０．０３ μ ｇ ／ ｋｇ ； ＡＦＢ １ 的定量限为 ０．３ μ ｇ ／ ｋｇ ， ＡＦＢ ２ 的定量限为 ０．１ μ ｇ ／ ｋｇ ， ＡＦＧ １ 的定量限为 ０．３ μ ｇ ／ ｋｇ ， ＡＦＧ ２ 的定量限为 ０．１ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ５４９０ 　 粮油检验 　 一般规则 ＧＢ ／ Ｔ５４９１ 　 粮食 、 油料检验 　 扦样 、 分样法 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 原理 样品中黄曲霉毒素经甲醇  水混合液提取 、 上清液经免疫磁珠净化 、 富集后 ， 采用超高效液相色谱分析 ， 外标法定量 。 ４ 　 试剂和材料 除另有说明外 ， 本方法所用试剂均为分析纯 ， 实验用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中规定的一级用水要求 。 ４ ． １ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 甲醇 ： 色谱纯 。 ４ ． ３ 　 氯化钠 。 ４ ． ４ 　 磷酸氢二钠 。 ４ ． ５ 　 磷酸二氢钾 。 ４ ． ６ 　 氯化钾 。 ４ ． ７ 　 盐酸 。 ４ ． ８ 　 ＴｒｉｔｏｎＸ１００ ［ Ｃ １４ Ｈ ２２ Ｏ （ Ｃ ２ Ｈ ４ Ｏ ） 狀 ］（ 或吐温 －２０ ， Ｃ ５８ Ｈ １１４ Ｏ ２６ ）。 ４ ． ９ 　 甲醇  水混合液 ７０∶３０ ， 体积分数取 ７０ｍＬ 甲醇加入 ３０ｍＬ 水 ， 混匀 。 ４ ． １０ 　 磷酸盐缓冲溶液 （ 以下简称 ＰＢＳ ）： 称取 ８．００ｇ 氯化钠 、 １．２０ｇ 磷酸氢二钠 （ 或 ２．９２ｇ 十二水磷酸氢二钠 ）、 ０．２０ｇ 磷酸二氢钾 、 ０．２０ｇ 氯化钾 ， 用 ９００ｍＬ 水溶解 ， 用盐酸调节 ｐＨ 至 ７．４ ， 用水定容至 １０００ｍＬ 。 １ 犔犛 ／ 犜 ６１３８ — ２０２０４ ． １１ 　 ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００ （ 或吐温 ２０ ） 的 ＰＢＳ 溶液 （ 以下简称 ＰＢＳＴ ）： 取 １ｍＬＴｒｉｔｏｎＸ１００ （ 或吐温 ２０ ）， 用 ＰＢＳ 定容至 １０００ｍＬ 。 ４ ． １２ 　 标准品 黄曲霉毒素 Ｂ １ 、 Ｂ ２ 、 Ｇ １ 、 Ｇ ２ 的固体粉末 （ 纯度 ≥ ９９％ ） 或经国家认证并授予标准物质证书的标准溶液 。 ４ ． １３ 　 标准溶液配制 ４ ． １３ ． １ 　 混合标准溶液分别准确移取一定体积或质量的 ４ 种黄曲霉毒素标准品 （ ４．１２ ） 于 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 配制黄曲霉毒 素 Ｂ １ 、 Ｂ ２ 、 Ｇ １ 、 Ｇ ２ ， 浓度分别为 １００ｍｇ ／ Ｌ 、 ３０ｍｇ ／ Ｌ 、 １００ｍｇ ／ Ｌ 、 ３０ｍｇ ／ Ｌ ， 用甲醇定容至刻度 ， 此溶液 －２０℃ 密封避光保存 ， 有效期 ６ 个月 。 ４ ． １３ ． ２ 　 标准系列工作溶液分别准确移取 ４ 种黄曲霉毒素混合标准溶液 （ ４．１３．１ ） ２５ μ Ｌ 、 ５０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ 、 ２５０ μ Ｌ 、 ５００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ 分别于 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 用甲醇定容至刻度 ， 配制标准曲线溶液浓度见表 １ ， 此溶液 ４℃ 避光密封保存 ， 有效期 １ 周 。 表 １ 　 标准曲线溶液浓度 单位 ： ｎｇ ／ ｍＬ 化合物名称 标曲点 １ 标曲点 ２ 标曲点 ３ 标曲点 ４ 标曲点 ５ 标曲点 ６ ＡＦＢ １ ０．２５ ０．５ １ ２．５ ５ １０ ＡＦＢ ２ ０．０７５ ０．１５ ０．３ ０．７５ １．５ ３ ＡＦＧ １ ０．２５ ０．５ １ ２．５ ５ １０ ＡＦＧ ２ ０．０７５ ０．１５ ０．３ ０．７５ １．５ ３ ４ ． １４ 　 塑料离心管 （ ２．０ｍＬ 、 １０ｍＬ 、 ５０ｍＬ ）。 ４ ． １５ 　 玻璃内插管 （ ４００ μ Ｌ ）。 ４ ． １６ 　 色谱进样瓶 （ ２ｍＬ ）。 ４ ． １７ 　 容量瓶 （ １０ｍＬ ）。 ４ ． １８ 　 黄曲霉毒素免疫磁珠前处理试剂盒 ： 回收率 ≥ ８５％ 。 注 ： 对于不同批次的试剂盒在使用前需进行质量验证 。 ５ 　 仪器和设备 ５ ． １ 　 天平 ： 感量 ０．１ｍｇ 和 ０．０１ｇ 。 ５ ． ２ 　 粉碎机 ： 电机转速 ≥ １０００ｒ ／ ｍｉｎ ， 可使试样粉碎后全部通过 ２０ 目筛 。 ５ ． ３ 　 离心机 ： 转速 ≥ ６０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ ． ４ 　 涡旋混合器 。 ５ ． ５ 　 振荡器 （ 振荡频率 ≥ ５０ 次 ）。 ５ ． ６ 　 单通道移液枪一套 （ 最大量程分别为 ２０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ）。 ５ ． ７ 　 分液器 （ 量程 １０ ～ １００ｍＬ ）。 ５ ． ８ 　 磁棒和磁棒套或含有磁棒和磁棒套的全自动净化仪 。 ５ ． ９ 　 超高效液相色谱  荧光检测器 （ 带一般体积流动池或者大体积流通池 ）。 注 ： 当带大体积流通池时不需要再使用任何型号或任何方式的柱后衍生器 。 ５ ． １０ 　 柱后衍生器 。 ２ 犔犛 ／ 犜 ６１３８ — ２０２０６ 　 分析步骤 ６ ． １ 　 扦样与分样 按 ＧＢ ／ Ｔ５４９１ 执行 ， 在采样过程中 ， 注意防止样品污染 ， 取代表性样品至少 １ｋｇ 。 ６ ． ２ 　 样品制备 ６ ． ２ ． １ 　 液体样品 （ 植物油 ） 将所有液体样品在一个容器中充分混合均匀 ， 储存于样品瓶中备用 。 ６ ． ２ ． ２ 　 固体样品 （ 小麦 、 玉米 、 稻谷等 ） 用粉碎机 （ ５．２ ） 将样品粉碎至全部通过 ２０ 目筛 ， 充分混合均匀 ， 储存于样品瓶中备用 。 ６ ． ３ 　 提取及净化 准确称取 ５ｇ （ 精确到 ０．０１ｇ ） 样品于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 加入 ２０ｍＬ 提取液 （ ４．９ ）， 涡旋提取 ２０ｍｉｎ ， 然后以 ６０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ， 吸取 ０．５ｍＬ 上清液于 １０ｍＬ 反应管中 ， 加入 ４．５ｍＬＰＢＳＴ （ ４．１１ ） 并混匀 ， 加入 １００ μ Ｌ 黄曲霉毒素免疫磁珠振荡反应 ５ｍｉｎ ， 通过磁棒 （ ５．８ ） 磁吸分离 ３０ｓ 后将免疫磁珠转移至含 １ｍＬＰＢＳＴ （ ４．１１ ） 的 ２ｍ