ICS71.040.30 G66 中华人民共和国国家标准 GB/T33410—2016 生化试剂中蛋白酶K活性检测方法 DeterminationoftheactivityofproteaseKinbiochemicalreagents 2016-12-30发布 2017-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位:深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、中国标准化研究院。 本标准主要起草人:林霖、周李华、赖心田、兰全学、马爱进、陈国培、李淅、潘兰芳、杨国武。 ⅠGB/T33410—2016 生化试剂中蛋白酶K活性检测方法 1 范围 本标准规定了生化试剂中蛋白酶K活性检测方法。 本标准适用于分子生物学实验中使用的蛋白酶K活性的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蛋白酶K活性单位 proteaseKactivityunit 在55℃,pH8.0时,1min内水解酪蛋白产生1μgL-酪氨酸为一个酶活性单位。 注:活性单位为U/mg、U/g或U/mL。 4 原理 蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶,可催化含有较多的丝氨酸位点的α-酪蛋白水解。 本方法中采用α-酪蛋白为反应底物,经蛋白酶K催化水解为L-酪氨酸,在275nm处测定吸光度值。再 通过测量各个浓度的L-酪氨酸标准溶液在275nm处的吸光度值,并构建标准曲线得出线性回归方程, 以外标法定量。计算蛋白酶K的酶活性。 5 仪器设备及器具 5.1 恒温水浴锅:控温精度±0.2℃。 5.2 pH计:精确至0.01pH。 5.3 紫外-可见分光光度计:吸光度值精确至0.001。 5.4 1cm石英比色皿。 5.5 电子天平:感量0.0001g。 6 试剂 除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6882规定的三级水。 1GB/T33410—2016 6.1 0.01mol/LTris·HCl缓冲液(pH8.0) 称取12.11gTrisbase(三羟甲基氨甲烷盐酸盐)加入适量去离子水使其溶解,定容到100mL,得 1mol/LTris·HCl缓冲液,用浓盐酸调至pH8.0;再取1mL1mol/LTris·HCl缓冲液加去离子水 定容至100mL,即得0.01mol/LTris·HCl缓冲液。 6.2 0.4mol/L三氯乙酸溶液 称取三氯乙酸65.40g,用去离子水溶解并定容至1000mL。 6.3 HCl溶液 量取8.33mL浓盐酸加入到50mL去离子水中,定容至100mL,得1mol/LHCl。 量取10.00mL1mol/LHCl加去离子水定容至100mL,得0.1mol/LHCl。 6.4 0.5mol/LNaOH溶液 称取2gNaOH,溶解于50mL去离子水中,定容至100mL。 6.5 10g/L酪蛋白溶液 称取酪蛋白标准品1.000g,用少量0.5mol/LNaOH溶液(6.4)湿润后,加入0.01mol/LTris·HCl 缓冲液(6.1)约80mL,在沸水中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转移至100mL容量瓶中,用适量 0.01mol/LTris·HCl缓冲液(6.1)定容至刻度。置于4℃保存备用。 6.6 100μg/mLL-酪氨酸标准储备液 称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,用60mL1mol/LHCl溶液(6.3)溶解后定 容至100mL,配成1mg/mLL-酪氨酸标准溶液。再吸取1mg/mLL-酪氨酸溶液10.00mL,用0.1mol/L 盐酸溶液(6.3)定容至100mL,即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备液。注意避光保存。 7 分析步骤 7.1 标准曲线的绘制 7.1.1 L-酪氨酸标准溶液 按表1配制L-酪氨酸标准溶液。 表1 L-酪氨酸标准溶液配制 管号酪氨酸标准溶液的浓度 μg/mL加入100μg/mL酪氨酸标准溶液的体积 mL加入去离子水的体积 mL 0 0 0 10 1 20 2 8 2 40 4 6 3 60 6 4 4 80 8 2 5 100 10 0 2GB/T33410—2016 7.1.2 吸光度值的测定 用紫外分光光度计,在275nm波长下,以不含酪氨酸的0号管为空白,用1cm石英比色皿,测定 其吸光度(A)。 7.1.3 吸光常数K值计算 以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线(此线应通过零点)。得出线性回 归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值。K值应在130~135范围内。 7.2 测试过程 7.2.1 待测酶液制备 称取1g(精确至0.001g)或吸取1mL(精确至0.001mL),根据结合样品具体情况,使用适量的 0.01mol/LTris·HCl缓冲液(6.1)稀释,使待测酶液比活力处于(0~160)U/g或U/mL之间。 7.2.2 空白对照试验 将10g/L酪蛋白溶液(6.5)放入55℃恒温水浴中,预热5min。 加入0.01mol/LTris·HCl缓冲液(6.1),55℃温浴2min;加0.4mol/L三氯乙酸(6.2)4.00mL, 摇匀,55℃温浴5min;加10g/L酪蛋白溶液(6.5)2.00mL,摇匀。取出静置5min,过滤。 加等量滤液至1cm石英比色皿,用紫外分光光度计于275nm处调零。 7.2.3 样品测试 将10g/L酪蛋白溶液(6.5)放入55℃恒温水浴中,预热5min。 加待测酶液(7.2.1)2.00mL,55℃温浴2min;加10g/L酪蛋白溶液(6.5)2.00mL,摇匀,55℃温 浴5min;加0.4mol/L三氯乙酸(6.2)4.00mL,摇匀。取出静置5min,过滤。 加等量滤液至1cm石英比色皿,用紫外分光光度计测定275nm处吸光度值,吸光度值应处于标 准曲线范围内。 每个样品设置两个平行样。 8 计算 8.1 结果计算 按式(1)计算酶活: X=N×8 5×d…………………………(1) 式中: X———为酶的比活力U/mg或U/mL; N———为275nm吸光度值带入L-酪氨酸标准曲线的公式中计算而得产生的L-酪氨酸浓度(μg/mL); 8———反应总体积为8mL; 5———反应水浴时间为5min,酶活单位定义以1min计; d———酶反应液中所含原酶粉质量(mg)或原酶液体积(mL)。 8.2 质量控制 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。GB/T33410—2016