(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211127936.1 (22)申请日 2022.09.16 (71)申请人 南京医科 大学 地址 211166 江苏省南京市江宁区龙眠大 道101号 (72)发明人 方一民　陈珊　王鹏程　孙俊杰　 郑玉皓　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 徐冬涛　李晓峰 (51)Int.Cl. G01N 21/84(2006.01) G01N 21/51(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 一种采用免标记单粒子成像技术快速检测 低浓度细菌的方法 (57)摘要 本发明公开了一种采用免标记单粒子成像 技术快速检测低浓度细菌的方法， 通过跟踪粒子 在自由溶液中的运动， 再根据粒子在溶液中布朗 运动时散射截面的变化来区分单个粒子的形态 异质性， 这有助于以免标记的方式从 复杂的基质 中识别单个细菌。 此外为了提高单粒子检测的灵 敏度， 通过诱导自由溶液的对流可 实现在反射增 强暗场显微镜的小视场中快速、 方便地筛选低浓 度的细菌。 通过这种方式， 我们能够子在十分钟 内(包括两分钟的样品预处理和5分钟的筛选)将 GBS阳性样本和阴性样本区分开来， 这是我们所 知的检测GBS细菌最快的方法。 与现有技术相比， 本发明检测速度快、 准确率高、 操作简单和成本 低， 将可能在传染病控制中找到更多潜在的应 用。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 115508351 A 2022.12.23 CN 115508351 A 1.一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的方法， 其特征在于， 该方法 根据粒子形貌的各向异 性所产生不同散射强度波动来直接鉴定细菌， 还根据粒子的大小 所 产生不同的光斑特征来进一步提高细菌筛选的准确性， 再通过诱导样品溶液的对流来实现 小视野中低浓度细菌的快速 筛选来提高检测灵敏度。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤： 将待测样品溶液盛 装于一个“三明治”结构的池子中， 所述的 “三明治”结构的池子以抛光硅片作为基底、 中间 是中空透明的聚二甲基硅氧烷(PDMS)池， 顶部设一个玻璃盖玻片； 在反射增强暗场显微镜 下使用汞灯光源获得 粒子的暗场散射图像； 在所述抛光硅片两端的底部分别放置两个加热片， 其中一个加热片在通电后会被加 热， 另一个加热片不 通电， 以诱 导池子底部溶 液的水平对流， 实现细菌的快速 筛查。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 通过引入抛光硅片作为反射面， 采用反射 增强暗场显微镜提高其检测灵敏度， 同时使用50倍暗场物镜和 CMOS相机实时记录在150 × 150 μm的视场下进入视野中粒子的散射图像。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述的反射增强暗场显微镜带有长焦距物 镜， 景深大， 能够实现自由溶 液中更多颗粒的清晰成像。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述的聚二甲基硅氧烷池是将二甲基硅氧 烷单体和二甲基硅氧烷固化剂以质量比10： 1混合并搅拌均匀， 注入至胶体模具内， 然后真 空干燥后得到的中空透明容器。 6.一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的装置， 其特征在于， 该装置 为一个“三明治”结构的池子中， 所述的 “三明治”结构的池子以抛光硅片作为基底、 中间是 中空透明的聚二甲基硅氧烷(PDMS)池， 顶部设一个玻璃盖玻片， 在反射增强暗场显微镜下 使用汞灯光源获得 粒子的暗场散射图像； 在所述抛光硅片两端的底部分别放置两个加热片， 其中一个加热片在通电后会被加 热， 另一个加热片不通电， 以诱导池子底部待测样品溶液的水平对流， 实现细菌的快速筛 查。 7.根据权利要求6所述的装置， 其特征在于， 通过引入抛光硅片作为反射面， 采用反射 增强暗场显微镜提高其检测灵敏度， 同时使用50倍暗场物镜和 CMOS相机实时记录在150 × 150 μm的视场下进入视野中粒子的散射图像。 8.根据权利要求6或7所述的装置， 其特征在于， 所述的反射增强暗场显微镜带有长焦 距物镜， 景深大， 能够实现自由溶 液中更多颗粒的清晰成像。 9.根据权利要求6所述的装置， 其特征在于， 所述的聚二甲基硅氧烷池是将二甲基硅氧 烷单体和二甲基硅氧烷固化剂以质量比10： 1混合并搅拌均匀， 注入至胶体模具内， 然后真 空干燥后得到的中空透明容器。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115508351 A 2一种采用免标记单粒子成像技术快速检测低浓度细菌的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及临床样本中低浓度细菌超快检测技术领域， 特别涉及一种采用免标记 单粒子成像技 术快速检测低浓度细菌的方法。 背景技术 [0002]细菌是自然界中数量最多、 分布广泛和形态多样的一类微生物。 细菌感染和病毒 感染约占人类所有致病性疾病的70％， 且细菌感染是导致人死亡 的主要原因之一， 它对人 类的健康和社会的危害巨大。 抗生素 的治疗通常是用来解决细菌感染的方法， 但是近年来 随着抗生素使用的增多， 具有抗生素耐药性的细菌菌株的出现正在增加， 这使得临床上可 使用抗生素 的选择性降低， 细菌性疾病治疗失败率逐渐升高， 并导致发病率和死亡率增高 及医疗费用的增加， 因此， 早期快速识别细菌并合理使用抗生素对防止抗生素 的滥用至关 重要。 如B族链球菌(Group  B Streptococcus， GBS)是一种兼性厌氧型革兰氏阳性球菌， 通 常寄居于阴道和直肠， 也是引起绒毛羊膜炎和 新生儿败血症的主要原因。 在怀孕期间约有 10％－40％的女性有GBS感染， 而携带GBS的孕妇在分娩过程中有40％－70％的可能会将该 病菌传染给新生儿， 导致新生儿早期的感染， 从而引起脑膜炎、 肺炎、 败血症等早发性疾病 (Early－Onset  Disease， EOD)， 甚至死亡。 即使在感染后存活的新生儿， 也可能有 严重的的 神经系统后遗症， 如癫痫、 精神运动发育障碍、 严重智力迟钝、 失 明和耳聋等。 因此， GBS感染 是引起新生儿致病甚至死 亡的重要原因之一。 [0003]携带有GBS细菌的孕妇是否会将GBS传染给新生儿， 与产妇分娩时的健康状况有 关， 且呈动态变化， 产前GBS检测结果与分娩过程中的检测结果没有很强的相关性。 目前临 床上对于待产孕妇大都采用抗生素干预来预防新生儿GBS的感染， 该方法虽然可以预防新 生儿GBS的感染， 但同样会造成抗生素的滥用。 因此， 在早期快速识别和 检测致病菌对疾病 控制和精准医疗至关重要， 这有助于在不滥用抗生素 的情况下进行恰当的治疗， 不仅可以 挽救生命， 还可以大 大降低由耐药性细菌所传播的疾病带来的医疗费用。 [0004]目前对于细菌的检测方法主要有细菌培养法和核酸扩增检测法(又称聚合酶链 反 应， Polymerase  Chain Reaction， PCR)。 虽然细菌培养法是GBS检测最基本的方法， 该方法 成本较低、 结果可靠、 灵敏度高， 但是耗时较长， 往往需要24到72小时才能得到检测结果， 这 会影响医生对疾病的及时诊断治疗， 可能造成病情延误。 PCR方法虽然检测灵敏度高、 耗时 短(＞1小时)， 但该方法成本高， 且在临床诊断中很难及时得到检测结果。 拉曼光谱法、 荧光 法、 电化学发光法等方法也被提出用于细菌的检测。 但它们的操作通常很复杂， 又由于目标 细菌含量低， 且临床样本中基质比较复杂， 往往需要长时间的样品预 处理和信号放大。 又由 于GBS感染的发病机制主要发生在分娩过程中， 在分娩过程的短时间窗口(几分钟)内快速 筛查GBS对临床病例至 关重要， 但目前还没有相关技术能够实现。 因此， 亟需开 发一种快速、 灵敏的细菌检测技 术， 实现GBS细菌的快速现场检测。说　明　书 1/6 页 3 CN 115508351 A 3