(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210803939.6 (22)申请日 2022.07.07 (71)申请人 中国医学 科学院医学生物学研究所 地址 650118 云南省昆明市茭菱路93 5号 (72)发明人 靳玮华　和占龙　张伟　李艳艳　 杨凤梅　陈丽雄　徐鸿界　李明学　 刘权　李咏洁　邓自君　唐洁　 张凡邦　孙文亭　 (74)专利代理 机构 成都宏田知识产权代理事务 所(普通合伙) 51337 专利代理师 钟隆辉 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12M 1/26(2006.01) C12M 1/02(2006.01)C12M 1/00(2006.01) (54)发明名称 一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置及 分离方法 (57)摘要 本发明公开了一种食蟹猴胎猴肾脏原代细 胞分离装置及分离方法， 其分离装置包括三通 管， 三通管的三个口分别通过第一管道、 第二管 道和第三管道连通细胞消化液瓶、 分散悬浮液瓶 和组织消化瓶； 组织消化瓶的一侧设有连通内部 的出液口， 出液口通过第五管道连接过滤器的一 端， 过滤器的另一端通过第四管道连通细胞收集 瓶。 本发明装置一次连接后即可完成组织的消 化， 消化细胞的多次分散与悬浮， 细胞悬液的过 滤与收集， 大大提高了细胞的分离效率。 无需多 次开口操作也极大的降低了操作过程中可能造 成的细胞污染风险， 对细胞分离时背景环境的要 求比传统的细胞分离方法要低很多。 相对于传统 分离方法具有更好的实用性和适用性。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115287249 A 2022.11.04 CN 115287249 A 1.一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置， 其特征在于， 包括三通管， 所述三通管的三 个口分别通过第一管道(1)、 第二管道(2)和第三管道(3)连通细胞消化液瓶(4)、 分散悬浮 液瓶(5)和组织消化瓶(6)； 所述组织消化瓶(6)的一侧设有连通内部的出液口(7)， 所述出 液口(7)通过第五管道(10)连接过滤器(9)的一端， 所述过滤器(9)的另一端通过第四管道 (8)连通细胞收集 瓶(11)； 所述第一管道(1)、 第二管道(2)、 第三管道(3)、 第四管道(8)、 第五管道(10)上均设有 止血钳(12)； 所述细胞消化液瓶(4)、 分散悬浮液瓶(5)上设有用于通入压空的第一开口 (13)和第二 开口(14)； 所述细胞收集 瓶(11)上设有用于抽气的第三 开口(15)。 2.一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离方法， 其特征在于， 应用如权利要求1所述的食蟹 猴胎猴肾脏原 代细胞分离装置实现， 具体包括以下步骤： S1、 获取怀孕150天的食蟹猴胎猴肾脏、 清洗、 剪碎， 转移至组织消化瓶(6)中， 并关闭第 一管道(1)、 第二管道(2)、 第三管道(3)、 第四管道(8)、 第五管道(10)上的止血钳(12)； S2、 将组织消化瓶(6)置于带有加热功能的磁力 搅拌器上， 打开第一管道(1)、 第三管道 (3)、 第四管道(8)、 第五管道(10)上的止血钳(12)， 将细胞消化液瓶(4)中的细胞消化液打 入到组织消化 瓶(6)中； S3、 启动磁力搅拌器， 搅拌消化组织块1h； 期间每隔20min打开第四管道(8)、 第五管道 (10)上的止血钳(12)抽走组织消化瓶(6)中的上清消化液， 重新补入新的细胞消化液； 抽取 过程须停止搅拌， 待组织 块自然沉淀后再抽取； S4、 消化结束后， 打开第二管道(2)、 第三管道(3)、 第四管道(8)、 第五管道(10)上的止 血钳(12)， 将分散悬浮液瓶(5)中的分散悬浮液打入到组织消化 瓶(6)中结束消化； S5、 分散悬浮5min后关闭磁力搅拌器， 待组织块自然沉淀后抽取上清液， 收集细胞、 离 心、 进行冻存或接种培 养。 3.根据权利要求2所述的食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离方法， 其特征在于， 步骤S1中， 获取的肾脏组织在3 0min内完成清洗 剪碎并开始消化。 4.根据权利要求2所述的食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离方法， 其特征在于， 步骤S2中， 加入的细胞消化液与胎猴肾脏组织 块的体积质量比为10:1。 5.根据权利要求2所述的食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所述细胞消化液包括0.1％II型胶原酶和0.1％IV型胶原酶与0.25％胰蛋白酶， 其体积比为 40： 40： 20 。 6.根据权利要求2所述的食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离方法， 其特征在于， 步骤S4中， 所述分散悬浮液包括RMP1640、 双抗、 3％谷氨酰胺、 6.6％碳酸氢钠、 新生牛血清， 其体积比 为88： 2： 3： 3： 4。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115287249 A 2一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离 装置及分离方 法 技术领域 [0001]本发明属于非人灵长类动物胚胎组织肾脏原代细胞分离技术领域， 具体涉  及一 种食蟹猴胎猴肾脏原 代细胞分离装置及分离方法。 背景技术 [0002]应对威胁人类的重大传染性疾病， 良好的卫生环境、 科学的防疫政策和措  施必不 可少。 目前人类应对突发、 多发的病毒性传染疾病， 接种预防性疫苗仍  是成本低、 见效快、 效果好的手段。 众所周知， 病毒是一种只有在细胞内才能  体现出生物活性的微生物， 如今 虽然有像 mRNA疫苗、 腺病毒重组疫苗、 DNA  疫苗等多种基于基因工程技术疫苗的不断出现， 但是仍然有 许多生产工艺、 技  术的瓶颈需要去突破。 传统的疫苗生产工艺至今仍然 是目前 广泛采用进行病毒  性疫苗生产最稳定的技术路线。 这一技术路线离不开的是宿主细胞 的 体外分离  及培养技术， 最成功的例 子就是我国采用恒河猴原代猴肾细胞生产的脊髓灰质   炎减毒活疫苗， 为我国和全世界消灭脊髓灰质炎立下了不可磨灭的贡献。 动物  肾脏细胞作 为一种良好的、 多种病毒适应性细胞至今仍然广泛应用于病毒分离  和培养、 新型疫苗研 发、 生产及药品质量控制等诸多领域。 因此分离和构建一  株安全、 稳定的动物肾脏细胞对 于病毒分离培养、 疫苗及药物的开发与评价、  药物的检定与质量控制等研究具有重要意 义。 [0003]目前对动物原代肾细胞的分离多采用单一的胰蛋白酶进行消化的技术， 具  有分 离效率低， 细胞获得数量少、 死细胞数量多、 细胞结团率高、 操作过程敞  口次数较多、 细胞 易污染、 细胞分离过程对背景环境要求较高等 不足。 [0004] 发明内容 [0005]针对现有技术中的上述不足， 本发明提供一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分  离装 置及分离方法。 [0006]为了达到上述发明目的， 本发明采用的技 术方案为： [0007]提供一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置， 包括三通管， 三通管的三个  口分别 通过第一管道、 第二管道和第三管道连通细胞消化液瓶、 分散悬浮液瓶  和组织消化瓶； 组 织消化瓶的一侧设有连通内部的出液口， 出液口通过第五管  道连接过滤器的一端， 过滤器 的另一端通过第四管道连通细胞收集 瓶； [0008]第一管道、 第二管道、 第三管道、 第四管道、 第五管道上均设有止血钳；  细胞消化 液瓶、 分散悬浮液瓶上设有用于通入压空的第一开口和 第二开口； 细  胞收集瓶上设有用于 抽气的第三 开口。 [0009]提供一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离方法， 应用上述食蟹猴胎猴肾脏原  代细 胞分离装置实现， 具体包括以下步骤： [0010]S1、 获取怀孕150 天的食蟹猴胎猴肾脏、 清洗、 剪碎， 转移至组织消化瓶  中， 并关闭说　明　书 1/5 页 3 CN 115287249 A 3