(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210561607.1 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 苏州大学 地址 215137 江苏省苏州市相城区济学路8 号 (72)发明人 庄文卓　 (74)专利代理 机构 苏州翔远专利代理事务所 (普通合伙) 32251 专利代理师 叶丙静 (51)Int.Cl. A61K 9/50(2006.01) A61K 31/69(2006.01) A61K 47/46(2006.01) C12N 5/0786(2010.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备 方法及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应 用 (57)摘要 本发明公开了负载硼替佐米的人单核细胞 外泌体的制备方法及其在制备治疗多发性骨髓 瘤药物中的应用， 在体外获得人单核细胞外泌 体， 并用此外泌体负载硼替佐米。 与单独使用硼 替佐米相比， 负载硼替佐米的外泌体对多发性骨 髓瘤细胞的增殖抑制作用更强。 并且小鼠原位骨 髓瘤移植瘤模 型证明， 使用负载了硼替佐米单核 细胞外泌体比使用硼替佐米具有更强的抑制肿 瘤生长能力。 为临床治疗多发性骨髓瘤提供了一 种新的治 疗方式。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 115227667 A 2022.10.25 CN 115227667 A 1.负载硼替佐米的人 单核细胞外泌体的制备 方法， 包括： (1)单核细 胞外泌体的提取及鉴定： 采用ficoll分离出人单个核细 胞层， 使用CD14磁珠 分离获得单核细胞； 在无血清培养体系培养人单核细胞， 收集细胞上清液， 采用旋转超滤结 合低温超速 离心方法收集纯化培 养基中的外泌体， 并鉴定； (2)硼替佐米标准曲线的测定， 做小量修改， 利用高效液相色谱法测定利奈唑胺的含 量； (3)将硼替佐米载入外泌体： 通过共孵育法将硼替佐米载入外泌体， 收取并纯化外泌 体。 2.根据权利要求1所述的负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法， 其特征在于， 在步骤(1)中， 所述旋转超滤结合低温超速离心方法包括： 将培养基置于4℃、 400g离心 5min， 去除游离细胞， 得到上清液， 并移入另一管中， 4℃、 12000g离心45min， 去除细胞碎片， 获得上清液， 并倒入millipore超滤装置中， 用PBS洗脱收集滤膜上的浓缩液体， 再次加入 PBS， 经millipore超滤装置再次超滤， 得到的浓缩液在4℃、 130000g的条件下离心120min， 重悬底部沉淀， 使用PBS转移至可截留100KD分子的超滤细心管中， 4℃、 130000g离心 120min， PBS洗涤3 次， 最终按后续实验要求定容至一定体积， 得到Exosomes悬液， 将外泌体 溶液用0.22 μm滤头过 滤除掉大颗粒杂质， 分装保存至 ‑80℃。 3.根据权利要求1所述的负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法， 其特征在于， 在步骤(1)中， 所述鉴定为： 收集外泌体后， 通过电镜、 粒径分析、 免疫 印迹方法对外泌体的 特性进行鉴定 。 4.根据权利要求1所述的负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)具体为： 称取适量硼替佐 米， 用ddH2O溶解， 配成10mM/L， 作为储备液， ‑80℃保存； 吸 取所述储备液适量， 加入流动相， 制成1， 5， 10， 20， 40， 80， 160 μM/L的硼替佐米溶液， 利用高 效液相色谱法测定利奈唑胺的含量。 5.根据权利要求4所述的负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法， 其特征在于， 所述高效液相 色谱法的色谱条件为： 色谱柱： C18  column； 流动相： 水 ‑乙腈， 75∶25； 流量： 1mL/min； 紫外检测波长： 270nm； 室温； 进样量： 20 μL。 6.根据权利要求1所述的负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)所述通过共孵育 法将硼替佐米载入外泌体， 收取并纯化外泌体的具体方法为： 100 μ g纯化的外泌体与50 μg硼替佐米轻轻混匀， 在恒温摇床上37℃轻轻摇动孵育48h， 获得混合 液， 将所述混合液用超速离心机130000 ×g离心120min， 初步去除未被包载进入外泌体的硼 替佐米， 将所述混合液加入PBS中， 清洗3遍， 用超速离心机130000 ×g离心120min， 彻底去除 多余的硼替佐米， 获得 纯化的外泌体负载硼替佐米。 7.负载硼替佐米的人 单核细胞外泌体在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115227667 A 2负载硼替佐米的 人单核细胞外泌体的制备方 法及其在制备治 疗多发性骨髓瘤药物中的应用 技术领域 [0001]本发明属于生命科学技术领域， 具体涉及 一种负载硼替佐米的人单核细胞外泌体 的制备方法及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。 背景技术 [0002]多发性骨髓瘤(multiple  myeloma,MM)是以恶性浆细胞聚集在骨髓并在血液或尿 液中出现单克隆蛋白(M蛋白)为特征的一种恶性疾病。 临床特点包括贫血、 骨痛、 感染、 肾功 能不全和高钙血症等。 目前MM占所有恶性肿瘤的1％， 约占血液系统恶性肿瘤的10％， 日益 成为严重的公共卫 生问题。 [0003]硼替佐米(Bortezomib,Btz)作为第一代蛋白酶体抑制剂， 极大地延长了MM患者的 生存时间。 Btz的主要作用机制是可逆地抑制26S蛋白酶体， 通过稳定NF ‑κB的调节单位IκB， 抑制NF‑κB的活性， 干扰IL ‑6的分泌， 有效地抑制MM细胞的增殖， 同时通过减少MM细胞中血 管内皮生长因子(VEGF)的分泌来发挥 抗血管生 成作用， 诱导MM细胞的凋亡。 目前以Btz为基 础的联合治疗方案也逐渐成为MM患者的一线诱导方案。 但是硼替佐米在临床 应用中出现了 以下缺陷： 1.药物作用期短， 体内药物蓄积时间不 足,胞内蓄积量； 90％的Btz在给药15分钟 内就能从血浆室中清除， 快速α半衰期为0.22 ‑0.46小时， 分布体积为500L； 2.给药方式复 杂， 需要反复给药： 硼替佐米常规使用剂量为1.3mg/m2， 第1、 4、 8、 11天静脉注射， 休息 10天， 21天为一个周期。 3.在细胞内的生物利用度低， 残留药物对正常组织及细胞毒副作用比较 大； 最常见的不良反应包括血液学毒性、 消化道反应、 各种感染、 带状疱疹、 周围神经病变以 及乏力。 靶向性低， 免疫原性高， 耐药明显， 是目前多发性骨髓瘤治疗效果 不佳的重要原因。 [0004]外泌体是近年来比较新颖的药物载体， 是指一种能被机体内大多数细胞分泌的直 径大约为30 ‑150nm的微小膜 泡， 具有脂质双层膜， 透射电子显微镜下呈双凹碟形或杯 状。 几 乎所有的哺乳动物细胞都可以分泌外泌体， 并且在组织细胞生理和病理情况下皆可持续分 泌。 外泌体也几乎存在于所有体液中， 在血液、 尿液、 唾液、 滑液、 脑脊髓液、 乳汁、 羊水、 精 液、 阴道分泌物、 腹水、 癌症病人的血清和血浆、 细胞培 养基等液体中都能发现外泌体。 [0005]经研究发现， 外泌体中富含核酸(microRNA、 lncRNA、 circRNA、 mRNA、 tRNA等)、 蛋 白、 胆固醇等。 外泌体不含有内质网内的蛋白质， 但高表达与主要组织相容性复合体以及整 合素等多种蛋白质相互作用的四分子交联体超蛋白家族， 如CD9， CD81， CD 63。 外泌体的表面 标志蛋白主要有CD63、 CD81、 CD9、 TSG101、 HSP27。 外泌体被细胞摄取通常分为一下三个步 骤： 识别并结合靶向受体细胞， 通过巨胞饮或微胞饮进入受体细胞内， 将内含物送至受体细 胞。 [0006]目前使用外泌体转载药物的类型主要有三类： 1.小分子化学药物， 如抗肿瘤药物 紫杉醇、 阿霉素、 姜黄素等； 2.核酸类药物， 如DNA、 mRNA、 siRNA、 非编码RNA： microRNA、 lncRNA、 circRNA等； 3.蛋 白质类药物， 如抗原等。 外泌体作为药物载体具有免疫原性低， 可 穿生物屏障， 亲和力高， 能逃避 溶酶体介导， 具有高度的生物兼容性及低毒性等明显的明显说　明　书 1/5 页 3 CN 115227667 A 3